METODE PEMERIKSAAN DAN IDENTIFIKASI BAKTERI Aeromonas hydrophila. PADA KOMODITI MAS KOI (Cyprinus carpio )

OLEH :NURUL FUADAH ARIFIN

PEMBIMBING :Drs. Yakub Sulaeman,M.Pd DAN Liliana Jafar,S.Pi

ABSTRAK :

Di balai besar karantina ikan pengendalian mutu dan keamanan hasil perikanan untuk mengidentifikasi bakteri kita harus steril terlebih dahulu dan alat dan bahan yang digunakan juga harus steril agar tidak terjadi kontaminasi silang maka dari itu keberhasil mengidentifikasi tergantung dari kesterilan alat dan bahan  yang digunakan, dalam pemeriksaan kita hanya ingin mengetahui apakah sampel tersebut positif bakteri Aeromonas hydrophila atau negatif Aeromonas hydrophila

Dalam pemeriksaan bakteri banyak tahap yang harus digunakan yang utamanya yaitu sterilisasi alat dan bahan, kemudian dilakukan isolasi bakteri, pemurnian bakteri, uji lanjut/uji biokimai dan yang terkhir ialah pembacaan uji biokimia/ identifikasi bakteri.

PENDAHULUAN

    A. Latar Belakang

Kondisi geografis provinsi Sulawesi Selatan untuk  sektor perikanan mempunyai potensi yang sangat tinggi untuk dikembangkan sebagai kegiatan usaha perikanan. Kegiatan usaha perikanan tersebut harus dilakukan sebaik-baiknya, yang dapat memberi manfaat kepada masyarakat, juga harus melindungi sumber daya hayati secara berkesinambungan.

Berkembangnya usaha perikanan tersebut diikuti pula dengan meningkatnya frekuensi lalu lintas komoditi perikanan yang sesuai dengan UU.NO.16 Tahun 1992,yaitu mencegah masuk dan tersebarnya HPIK baik masuk dan keluar wilayah Republik Indonesia, maupun dari suatu area ke area yang lain.

Dalam usaha pencegahan masuknya Hama Penyakit Ikan Karantina (HPIK) dari luar negeri ke Indonesia dan mencegah penyebarannya antar wilayah di Indonesia, diperlukan suatu tindakan karantina, hal ini diperlukan  sebagai upaya pemcegahan penyebaran bibit penyakit. Beberapa kasus penyakit bakterial telah terjadi dibeberapa negara misalnya di Amerika 

Serikat 60-70% dari ikan hias impor adalah dari asia tenggara termasuk Indonesia .dari Amerika Selatan 5%  dan sisanya adalah ikan asli terutama dari florida, dimana hasil pengamatan bakteriologi menunjukan 68% ikan yang dari Asia Tenggara mengandung bakteri didalam darah, lendir, daging, dan air medium .

Dampak meningkatnya lalu lintas perikanan tersebut adalah semakin memberi peluang terjangkitnya HPIK di wilayah Republik Indonesia khususnya di daerah Sulawesi Selatan.

Balai Besar Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Makassar melakukan pengawasan terhadap komoditi perikanan yang dilalulintaskan termasuk komoditi mas koi (Cyprinus carpio sp) yang disertai dengan sertifikat (Health Certificate).

Untuk itu  perlu di adakan upaya mencegah masuk dan tersebarnya Hama Penyakit Ikan (HPI), dilakukan melalui kegiatan Karantina Ikan dimana berdasarkan  Undang-Undang Nomor : 16 tahun 1992 tentang Karantina Hewan, ikan dan tumbuhan dan dalam Peraturan Pemerintah Nomor : 15 tahun 2002 tentang Karantina Ikan adalah institusi pemerintah yang memiliki  Tugas dan Fungsi (Tusi) sebagai pengamatan terdepan di dalam upaya mencegah masuk dan tersebarnya  Hama dan Penyakit ikan  Karantina (HPI/HPIK) yang mempunyai potensi merusak kelestarian sumber daya hayati perikanan, baik yang berasal dari kegiatan antar area, dalam negeri (domestik masuk/keluar), maupun kegiatan Ekspor/ impor. Selain itu di perlukan penerapan sistem pemeriksaan  dan metode  diagnosa/identifikasi  Hama dan Penyakit  Ikan secara  tepat  yang di dukung oleh sarana dan prasarana  yang sesuai dengan pendekatan  sistem dan metode terbaru. 

Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) adalah semua Hama dan Penyakit Ikan yang belum terdapat dan/atau telah terdapat hanya di area tertentu di wilaya Negara Republik Indonesia yang dalam waktu relatife cepat dapat mewabah dan merugikan sosial ekonomi atau yang dapat membahayakan kesehatan masyarakat.

Mas koi merupakan komoditi perikanan yang saat ini mempunyai nilai ekonomis tinggi dimana mas koi merupakan komoditi perikanan yang banyak diminati karena daya tarik yang tinggi, selain daya tarik yang tinggi  warna dan corak pada tubuh ikan mas koi yang banyak diminati, sehingga permintaan ikan mas koi terus meningkat, baik ekspor maupun domestik.

Berdasarkan pada hal-hal diatas, maka judul yang penulis ambil dalam Praktik Kerja Lapang (PKL) ini yaitu ”Metode Pemeriksaan dan Identifikasi Bakteri Aeromonas hydrophyla  pada komoditi ikan mas koi (Cyprinus carpio) di Balai Besar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Makassar”

B.  Kegiatan - Kegiatan

1. Sterilisasi Alat Dan Bahan

 Sterilisasi adalah suatu proses atau kegiatan yang bertujuan untuk  membebaskan suatu alat atau bahan dari bentuk kehidupan. Sterilisasi alat dan bahan yang dilakukan di BBKIPM adalah sebagai berikut:

a. Sterilisasi Kering

          Sterilisasi kering yang digunakan yaitu dengan menggunakan oven. Sterilisasi ini digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari kaca atau gelas seperti tabung reaksi, cawan petri, tabung erlenmeyer, pipet dan sebagainya. Alat yang akan disterilkan terlebih dahulu di masak menggunakan kompor dengan suhu tinggi hingga panci yang berisi alat dan bahan bekas bakteri mendidih, lalu dilakukan kegiatan mencuci alat dan bahan menggunakan deterjent kemudian itu dibilas menggunakan larutan alkohol 70% setelah itu dikeringkan dan dibungkus menggunakan kertas bersih(kertas kopi) dengan rapi jangan sampai ada cela agar tidak terjadi kerusakan seperti alat dan bahan pecah atau hangus lalu dimasukkan kedalam oven disusun dengan rapi. Suhu yang digunakan pada oven yaitu 160 0C selama 2 jam, hal ini dimaksudkan untuk mengoksidasi cairan yang ada pada tubuh bakteri sehingga terjadi suatu dehidrasi dan pada akhirnya dapat membunuh mikroorganisme tersebut yang tidak diinginkan.

b.  Sterilisasi basah

Sterilisasi Basah yaitu sterilisasi yang menggunakan suhu panas dan uap air secara bersamaan dengan menggunakan autoclave. Umumnya digunakan untuk mensterilkan bahan yang akan digunakan seperti bahan uji ataupun bahan media tumbuh. Hal ini sesuai dengan pendapat Hadioetomo( 1993) yang menyatakan bahwa sterilisasi dilakukan dalam autoclave dengan suhu 121 0C dalam waktu 15 menit dengan tekanan 1 atm. Suhu ini merupakan ketetapan, karena umumnya organisme tidak dapat bertahan hidup pada suhu dan waktu tersebut. Setelah 15 menit, maka autoclave dapat dimatikan. Biarkan autoclave sampai tekanannya menjadi 0 atm dan suhu kurang dari 100 0C, setelah itu media dapat dikeluarkan.

2. Pembuatan Media Tumbuh

Media biakan merupakan suatu zat yang digunakan untuk menumbuhkan jasad renik di laboratorium, fungsi dari suatu media biakan adalah memberikan tempat kondisi yang mendukung pertumbuhan dan perkembangbiakan dari mikroorgansme yang di tumbuhkan. Oleh sebab itu setiap media harus memenuhi nutrient yang ditumbuhkan oleh bakteri agar dapat berkembang biak. 

Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media. Sejumlah besar mikroorganisme memerlukan unsur-unsur yakni unsur lengkap, vitamin-vitamin dan senyawa tambah lain. Umumnya media yang digunakan TSA (Tryptic Soy Agar) dan BHIA (Brain Heart iron Agar). Median ini dilarutkan dengan aquades dan dihomogen diatas hot plate dan Stirrer lalu di autoclave untuk menghindari terjadinya kontaminasi, kemudian dituang kedalam cawan petri sebanyak 20 ml dan tabung reaksi sebanyak 10 ml. penuangan media tumbuh dilakukan di laminary flow untuk mencegah agar media tumbuh yang dituang tidak terkontaminasi dengan dunia luar. Setelah itu, dilakukan penuangan di cawan petri  dalam laminari flow , media dituang sebanyak 20 ml pada cawan petri dan 10 ml pada tabung reaksi dan dilakukan sterilisasi kembali menggunakan ultra violet (UV).

B. HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Isolasi Bakteri

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya seperti yang terdapat pada organ organisme (ikan), sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni bakteri. Mengisolasi bakteri dilakukan di dalam laminary flow secara aseptik dan teliti . Teknik isolasi bakteri terdiri dari 2 yaitu teknik ulas dan teknik gores, untuk ikan yang masih larva digunakan teknik ulas yaitu dengan menggerus larva tersebut hingga halus menambahkan pengencer berupa aquades 2 ml, hasil dari campuran tersebut diambil menggunakan pipet kemudian dimasukkan ke dalam media tumbuh lalu diulas secara merata. 

Pada ikan Mas menggunakan teknik gores. Bakteri diisolasi menggunakan jarum inokulum (ose) yang terlebih dahulu dipanaskan di api bunsen, hal ini dilakukan agar tidak terjadi kontaminasi bakteri dari udara. Jarum ose yang telah dipanaskan lalu ditusukkan ke organ target yang di duga mengandung pathogen dan selanjutnya digoreskan kepermukaan media BHIA secara zig-zag dan hati-hati. Setelah proses isolasi bakteri selesai, maka media tumbuh tersebut dimasukkan ke dalam ikubator dengan suhu 27 0C – 30 0C dan diinkubasi selama 24 – 48 jam.

b. Pemurnian Bakteri

Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Pemurnian dilakukan dari isolasi bakteri yang telah diinkubasi selama 24 – 28 jam, bakteri yang telah diinkubasi biasanya terdiri dari beberapa koloni bakteri. Sehingga diperlukan pemurnian bakteri secara aseptik agar kita hanya memperoleh satu jenis bakteri saja didalam media tumbuh tersebut 

Banyak kesulitan yang dihadapi dalam mengidentifikasi bakteri karena penggunaan sediaan bakteri yang tidak murni sejak awal kegiatan isolasi dan identifikasi bakteri dilakukan. Sebelum organisme dapat diidentifikasi, bakteri tersebut harus dipersiapkan terlebih dahulu dalam keadaan murni (kultur murni). Hal ini berarti bahwa bakteri yang tumbuh berasal dari satu induk. Jika ada 2 organisme atau lebih yang tumbuh pada media kultur, satu dari 4 kemungkinan dapat terjadi:

1).   Setiap organisme tumbuh secara independen. 

2). Satu jenis bakteri mungkin memproduksi substansi yang menunjang  pertumbuhan bakteri lainnya (sinergi), 

3)  Satu jenis bakteri menghasilkan substansi yang menghambat perkembangan bakteri lainnya, 

4)  Satu jenis bakteri dapat tumbuh lebih cepat dari lainnya dan menghambat bakteri lainnya terhadap beberapa elemen penting dalam suplai makanan.

Pemurnian dilakukan dengan 4 goresan, bakteri diambil dari media tumbuh BHIA secara aseptik dan digoreskan pada media kultur murni BHIA, setelah goresan pertama selesai, lalu jarum ose dipanaskan dan setelah dingin dilakukan goresan kedua, dari goresan kedua ke goresan ketiga tidak perlu memanaskan jarum ose, hal ini dimaksudkan jumlah koloni bakteri dari goresan kedua sudah mulai sedikit, sedangkan goresan keempat terpisah dari goresan 1, 2 dan 3. Setelah kultur murni selesai, bakteri tersebut diinkubasi dengan suhu 270C – 30 0C selama 24 – 28  jam di inkubator.

Proses pemurnian bakteri ini dilakukan unuk mendapatkan koloni bakteri yang benar-benar murni. Untuk bakteri Aeromonas hydrophila mempunyai karakteristik sebagai berikut, cembung dengan pigmen yang agak kecoklatan (Alifuddin.1993).

Tabel 5. Karasteristik Aeromonas hydrophila

KARAKTERISTIK	Aeromonas hydrophila
Acid Production From :
1. Lactose	-  (+)
2. Maltose	+
3. Sucrose	(+)  -
4. Phenylalanine diaminase	-
Oksidase	+
Christensen’s urea	-  (+)
Simmon’s Citrate	(+)  -
Motility	+
Arginine dihydrolase	+
Lysin decarboxylase	-  (+)
Ornithin decarboxylase	-

Sumber  :  Marvin L. Speck, 1977

c. Uji Lanjut/uji biokimia

Uji biokimia dilakukan untuk dapat mengidentifikasi bakteri yang menyerang ikan, selain dengan melihat bentuk dan warna koloni bakteri. 

1) Pewarnaan gram

Tujuan dari pewarnaan bakteri adalah Mengamati bentuk morfologi dan membedakan struktur yang terdapat dalam sel bakteri. Penentuan gram (+) dan gram (-) dilakukan berdasarkan pembentukan reaksi warna terhadap pigmen selnya. Warna ungu/violet menunjukkan gram (+) sedangkan warna merah menunjukkan gram (-). 

Salah satu teknik perwarnaan yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram (irawan, 2008). Uji pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bentuk dari koloni bakteri tersebut dan untuk menentukan warna bakteri apakah termasuk dalam gram negative atau gram positif. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan antara lain Kristal violet, larutan yodium, alkohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai.

Beberapa proses pewarnaan gram yaitu mengambil biakan bakteri, lalu digoreskan diatas objek glass dan diratakan tipis-tipis agar bakteri tersebut tidak menumpuk sehingga mudah diamati, setelah kering lalu difiksasi diatas api Bunsen agar bakteri tersebut benar-benar melekat pada objek glass, tetapi perlu diingat bahwa proses fiksasi jangan terlalu lama dan panas karena dapat menyebabkan bakteri rusak. Setelah fiksasi dilakukan pewarnaan yaitu gram A (Kristal violet) yang menberikan warna ungu pada bakteri dan dilakukan selama 1 menit, kemudian dicuci atau dibilas dan dikeringkan. Setelah gram A dilanjutkan pada gram B (iodine) selama 1 menit, lalu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah kering dilanjutkan pada gram C (ethanol) selama 30 detik, lalu dibilas dan dikeringkan, dan yang terakhir adalah gram D (safaranin) selama 2 menit lalu dibilas dan dikeringkan. Setelah kering lalu diamati dibawah mikroskop.

Hasil Pewarnaan Gram A.hydrophila

     Adapun hasil yang diperoleh pada sampel yang diisolasi dari bakteri ikan Mas  pada target lesi di badan dan ginjal setelah melakukan pengamatan ditemukan bakteri Aeromonas hydrophilla berwarna merah muda bersifat negatif (-) dengan bentuk batang (Road) , maka pewarnaan gram adalah (R-) .(Gambar 15).

2) Media  oksidase

Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri tersebut. jika kertas oksidase berwarna biru maka uji oksidase positif, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna maka uji oksidase negatif.

3) Media  MIO

Uji MIO terdiri terdiri dari motil, indol dan ornithin. dilihat perubahan yang terjadi. Apabila biakan bakteri menyebar dari garis tusukan maka motil positive, sedangkan apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu maka ornithin positive dan apabila terjadi cincin merah setelah pemberian larutan kovak’s maka indol positive. 

4) Media  Lysine decarboxilase

Media  LIA  terdiri dari  goresan  miring/slant  (diaminase)  dan  tusukan  lurus/butt  (decarboxylase),  Jika  terjadi  perubahan  warna  pada  slant  dan  butt  menjadi  ungu  tua  maka  uji  LIA  ini  positif,  dan  apabila  tidak  terjadi  perubahan  warna  maka   pembacaannya  negative.  Media  akan  berubah  warna  menjadi  hitam  apabila  bakteri  yang  diuji  mampu  menghasilkan  gas  (H2S).

5) Media  Urease

Uji  urease  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan  bakteri  menghasilkan  enzim  Urease.  Jika  terjadi  perubahan  warna  dari  kuning  menjadi  merah  muda,  maka  uji  Urase  positif  dan  apabila  tidak   terjadi  perubahan  warna  pada  media  urea  maka  uji  Urease  negative.

6) Media  Lactose,maltose , dan sukrose, L-phenyle

Uji  gula-gula  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  kemampuan bakteri  melakukan  fermentasi  karbohidrat.  Jika  terjadi  perubahan  warna  maka  pengujian  tersebut  positif  dan  apa  bila  tidak  terjadi  perubahan  warna  maka  pengujian  tersebut  hasilnya  negatif.

7) Media  Simons citrate agar (SCA)

Uji  SCA   Setelah  diinkubasi,  diamati  perubahan  warna  yang  terjadi.  Jika  terjadi  perubahan  warna  dari  hijau  menjadi  biru  maka  uji  SCA  positif,  sedangkan  apabila  tidak  terjadi  perubahan  warna  maka  uji  SCA  negatif.

8) Media  Arginine

Uji  Arginine  dihydrolisis  Jika  terjadi  perubahan  warna  dari  kuning  menjadi  merah  muda  berarti  uji  Arginine  positive,  sedangkan  apabila  tidak  terjadi  perubahan  warna  maka  uji  Arginine  negative.

c .  Identifikasi  Bakteri

Identifikasi bakteri adalah membandingkan bakteri yang belum diketahui dengan bakteri yang sudah 

Identifikasi mikroba berguna untuk mempelajari secara detail karakter fisik, kimiawi, dan biologis mikroba.

C.Kesimpulan dan saran

kesimpulan

Adapun kesimpulan yang dapat di ambil dari praktek kerja lapang di Balai Besar Karantina Ikan Pengendalian Mutu Dan Keamanan Hasil Perikanan Makasar adalah sebagai berikut:

a. Seluruh kegiatan Mikrobiologi harus di lakukan dalam keadaan steril dan alat dan bahan yang akan di gunakan dalam kegiatan Mikrobiologi harus disterilisasikan terlebih dahulu untuk menghindari kontaminasi dari luar.

b. Kegiatan metode Identifikasi meliputi isolasi bakteri , pemurnian bakteri, pewarnaan gram, uji lanjut, pembacaan uji lanjut dan identifikasi bakteri.

c. Media yang di gunakan dalam metode Identifikasi bakteri ini yaitu media tumbuh BHIA dan media-media uji lanjut  yang terdiri dari uji pewarnaan Gram, uji  Oksidase, Mio, Urease, SCA, Arginin Dihydrolisis, Laktosa, Sukrosa, Maltosa dan L-phenil.

d. Indikator dari hasil pengujian biokimia  bakteri Aeromonas hydrophila memiliki karasteristik yaitu bentuk sel batang (road), motil , gram (-), oksidase (+), arginine (+), dan ornithin decarboxylase (-),dan maltosa (+).

B. Saran 

a. Dalam setiap kegiatan pemeriksaan sesuai dengan prosedur yang telah dibuat setiap melakukan kegiatan harus memenuhi prosedur  di antaranya Menggunakan masker, Handscool, dan baju laboratorium, namun terkadang hal ini  di abaikan, setiap melakukan kegiatan di Laboratorium seharusnya memenuhi segala bentuk prosedur yang ada agar tidak terjadi kontaminasi silang pada saat pengujian bakteri.

b. Hendaknya selalu menjaga mutu dan kesterilan media uji( baik media agar maupun media cair ), alat, serta keadaan ruangan dari kontaminasi luar sehingga tidak terjadi kesalahan dalam mengidentifikasi bakteri pada waktu pembacaan hasil pengujian. 

c. Sebaiknya pada waktu kegiatan pemeriksaan bakteri, tidak menggunakan AC untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi silang terhadap manusia, sebab kontaminasi dalam jumlah yang besar akan memberikan efek terhadap kesehatan manusia. 

DAFTAR PUSTAKA

Afrianto dan Liviawathy.1999, identifikasi penyakit.

Alifuddin, 1993,kultur murni, 

Anonim, 1992. http://id.wikipedia.org/wiki/Perikanan. 

Austin, B. dan Dawn. 1993. 9http://id.wikipedia.com/go). 

Buller, N.B., 2004. Bacterial from fish and other aquatic animals : A practical identification manual. Cabi Pub. Massachusetts, USA

Craig , 2007. Directorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan. Kementrian Kelautan dan Perikanan. (http://id.wikipedia.com/go), 

Fulton, MacDonald. 2003, aeromonas hydrophila.

Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Pt. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta, diakses 20 maret 

Heru dan Agus. 1996 penyakit Aeromonas hydrophila.

Marvin,L.Speck . 1976 , klasifikasi Aeromonas hidrophila.

Taupik dan Bastian. 2003. Aeromonas hidrophila. 

Yuasa, Kei, dkk. 2003. Pandungan Diagnosa Penyakit Ikan. (www.lintasberita.com/go)